大家好今天喆圖小編給大家?guī)?lái)的是使用恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋做細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法原理

        細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞 
儀器、耗材 微量加樣槍、吸頭、離心管、凍存管、槍頭膠、塞移液管、玻璃瓶、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮、膏移液槍、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱、

1. 儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴鍋、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

5. 試劑：D-Hanks液、小牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油。

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液。

3. 離心1 000 rpm，5 min。

5. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml。

7. 凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入水浴鍋37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

3. 離心， 1 000 rpm，5 min。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。收起

 2. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作，以免凍傷。

其他

二、慢凍程序

2. 簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線(xiàn)繩，通過(guò)線(xiàn)繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜，次晨投人液氮中。

 三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。

1. 預(yù)先配制凍存液 （1）10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液） （2）10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。液氮長(zhǎng)期保存。

1. 快速解凍 凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入3中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò)3 分鐘）。

3. 如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感 解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

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